遗传病基因检测结果阴性后该怎么办?

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更新时间：2023-08-12 15:26:31发布时间：24小时内

　　随着医疗技术的发展，“罕见病”诊断与治疗越来越受到重视。据统计目前发现罕见病多达10867种，其中包括遗传性和非遗传性罕见病，大约87%的罕见病都有已知或疑似的遗传基础。据最新OMIM数据库(人类孟德尔病数据库)显示，目前已知的单基因遗传病的病种数量达7000多种。罕见病的诊断周期从几个月到几十年不等，主要取决于患者的表型、年龄和可用资源。为了尽早实现精准诊断、治疗、指导生育，基因检测技术几乎已成为遗传病诊断的终极手段。然而，基因检测并非万能，尽管WES、WGS等技术已成为多种遗传疾病的一线全面检测技术，但仍可能出现报告阴性的情况。

　　当全外显子(WES)阴性时

　　全外显子测序(WES)是对人类基因组中几乎所有2万多个基因的外显子区进行捕获测序，主要检测蛋白质编码区及其上下游10bp区域的SNV、InDel、CNV等变异类型。虽然这些区域只占人类基因组的不到2%，但约80%的遗传性疾病相关变异都在该区域，因此WES在临床应用中非常广泛。

　　近年来，随着技术升级，WES在检测上实现了更多变异类型的覆盖，例如部分动态突变、已知致病的深度内含子区变异、UPD、LOH和线粒体基因组变异等。但需要指出的是：WES检测准确性仍需要进一步验证。采用父母+先证者的TrioWES模式相较于单人WES能够提高诊断率，但WES对于某些区域覆盖范围不均匀，尤其是在第一个外显子、高GC/AT和低复杂度等区域，仍然存在受捕获探针特异性限制的问题，因此在准确度上仍存在局限，无法捕获某些变异。

　　为提高诊断率，针对WES检测阴性的未确诊患者建议如下：

　　当WES未获得诊断时应考虑全基因组和转录组测序，深入探讨可疑变异。

　　可根据患者表型、疑似疾病方向等，考虑代谢组学、蛋白质组学或甲基化分析。

　　应建立自动化流程，定期重新分析基因组数据并结合所有测序数据识别具有相似表型或相似基因突变的患者。

　　应进行功能研究以支持假定变异的因果关系并了解罕见疾病的分子机制。

　　当全基因组(WGS)阴性时

　　全基因组测序(WGS)包含核基因组、线粒体基因组，可以同时检测SNV、InDel、CNV、SV、动态突变、UPD、深度内含子区变异、线粒体基因组变异等多种变异类型，从而在很大程度上弥补了WES的局限性。

　　然而，如果在30×以下的深度下进行WGS检测，嵌合突变仍具有一定的风险。在数据解读方面也存在许多挑战，其中图2所示的是：(i)对于已知疾病基因、新疾病基因或非编码变异中的意义未明变异(VUS)的解读;(ii)对于隐性疾病中缺失的第二个变异，当致病变异位于难以测序的区域，或由于参考基因组和基因组数据集的偏差而可能检测不出。当WGS未检测到病因或解读结果不明确时，可以进一步采用替代技术、信息学工具和实验方法来辅助分子诊断。随着算法优化和新的疾病基因的不断发现，同时互补组学技术(如RNA-seq、代谢组学和蛋白质组学)的积极发展，WGS的诊断率将会持续提高。

　　通过对文献、会议等报道进行总结，主要可将遗传病基因检测报告阴性情况分为两大类：真阴性、假阴性。

　　1、真阴性及其对应解决策略

　　真阴性—非单基因遗传病

　　目前应用于临床的检测技术主要针对的是单基因遗传病，对于多基因遗传病不完全适用。多基因遗传性状是受微效累加基因和环境因素共同作用形成的一种性状，这些微效基因没有显性和隐性之分，是共显性，具有累加效应，并受环境因素的影响，具有家族倾向，也称为多基因疾病、多因子疾病或复杂疾病。常见多基因遗传病包括先天性心脏病、小儿精神分裂症、自闭症、家族性智力低下、脊柱裂、无脑、少年型糖尿病、先天性肥大性幽门狭窄、先天性心脏病、消化性溃疡、冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)、重症肌无力、先天性巨结肠、气道食管瘘、先天性腭裂、先天性髋脱位、先天性食道闭锁、马蹄内翻足、原发性癫痫、躁狂抑郁性精神病、尿道下裂、先天性哮喘、睾丸下降不全、脑积水、原发性高血压、冠心病等。对于这些疾病，WES、WGS仅能排查部分由单基因因素致病的情况，而对于多基因因素致病情况，一般需要全基因组关联研究(GWAS)。如自闭症，有研究表明，5%～10%的自闭症患者是由单基因变异所致，当推荐WGS作为首选检测方案时，诊断率可达40%左右。而仍有一大部分自闭症的发生是多个基因的共同作用，相关GWAS研究表明，大多数基因变异对自闭症的发生和发展仅具有较小的作用，因此需要很多的变异共同作用。

　　真阴性—非遗传病

　　不同疾病遗传因素的贡献不同，检测前评估非遗传的因素是必要的。比如临床怀疑是共济失调，在进行基因检测前需要通过一系列临床辅助检查来排除后天获得性病因，如感染性病因、免疫性病因等。这也是未一医学一直秉持着以疾病为导向的一体化诊疗策略提出的初衷，我们希望通过建立更加全面完善的诊断体系，来协助临床进行诊断和辅助诊断。目前未一医学已搭建20余项一体化检测方向，其中脑炎一体化、共济失调一体化等已成立专门的专家协作组，希望能为疾病的诊疗贡献更多的力量。

　　真阴性—尚未发现致病基因

　　人类基因组计划的完成减少了疾病基因定位的许多障碍，并使罕见单基因疾病的致病基因发现数量增加了四倍。但目前仍然有50%以上罕见病的遗传学病因尚不清楚。对于基因检测阴性，但当患者临床表现与家族史均支持的情况下，则提示可能是一个值得研究的方向。而对于这类研究，研究者一般通过大规模人群队列的标准化基因组测序和表型分型的模式来进一步研究遗传学病因，通过搜索数据库中疾病相关的家系，并使用生物信息学和体外功能实验来验证并确定新基因与罕见病的相关性。

　　2、假阴性及其对应解决策略

　　假阴性原因较多，最大限度避免本应检出，却因一些原因未能检出的情况是十分必要的。

　　探针捕获问题

　　选择最优的全外试剂盒进行检测，同时应不断优化，尽量避免漏检，对于不易捕获区域，应调整探针进行加密。

　　二代测序测不准或测不出的变异

　　这两类是不同严重程度的同类问题，可以用类似的方式进行解决，比如动态突变、假基因、非编码区、结构变异、表观遗传等，当然可以通过改变生信分析流程、增加特殊方法学、WGS、三代测序等进行补充。如图4中相关疾病，在开始选择检测方案的时应注意，可优选NGS+特殊方法学的组合类项目或者优选WGS的检测。

　　测序质量不过关

　　实验室应做好各环节质控，定期参加室内、室间质评，确保规范。

　　生信分析的漏掉

　　不同生信团队的水准差距较大，对于生信流程的优化和人员的培训是非常重要的，这也是后期数据重分析过程中获得进步的一个重要因素。

　　变异筛查和评判

　　各类指南共识、数据库均在不断的优化，人员应定期培训，相关变异黑、白名单应重点关注，如假基因等特殊情况需进行验证。