早发性卵巢功能不全(POI)的致病突变概览

　　卵巢早衰(POI)以卵巢功能停止为特征，影响了3.7%的小于40岁女性，并且是女性不孕的常见原因。POI的病因非常多样化，可能由自发的遗传缺陷或自身免疫疾病、感染或医源性因素引起。然而，大部分POI病例是特发性的，有多方证据支持其病因具有遗传基础。因此，确定POI的分子基础对于研究治疗靶点(如体外激活)以及指导遗传咨询或怀孕计划至关重要。

　　近年来，高通量测序技术的进步极大地拓展了人类对POI发病机理的理解，目前大约有90个基因与孤立性或综合性POI有关。然而，已知基因的变异仅解释了少部分患者的病因，表明POI具有很高的遗传异质性。此外，先前研究中样本规模有限、对照不足，阻碍了建立统计学上强有效的单基因关联以及发现新的致病基因。本研究进行了据我们所知至今规模最大的POI患者全外显子组测序研究，并进行了病例-对照分析，系统地探索了POI的遗传因素。

　　患者队列

　　从附属生殖医院招募了1,790名散发性POI患者进行初步评估。POI的诊断基于欧洲人类生殖和胚胎学会(ESHRE)的指南：(1)40岁前至少4个月的月经稀少或闭经，(2)促卵泡激素(FSH)水平在两次检查中均>25 IU/L，间隔超过4周。我们排除了存在染色体异常和其他已知非遗传原因的POI患者(包括自身免疫疾病、卵巢手术、化疗和放疗)。最终cohort包括1,030名POI患者，其中包括120例原发性闭经(PA)和910例继发性闭经(SA)。临床特征总结在补充表1中。在继发性闭经患者中，月经稀少或闭经发作的平均年龄为22.2岁。

　　已知POI致病基因中致病变异的鉴定

　　首先量化了95个已知POI致病基因中致病变异对POI贡献率(定义为病例百分比)的贡献(见补充表2)。这些已知致病基因中的变异致病性是根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG Genomics方法确认为复合杂合。)的指南或ClinVar的手动审查评估的(方法和补充表3)。我们优先考虑了这些已知致病基因中的致病性(P)和可能致病性(LP)变异进行贡献分析。

　　由于不确定意义变异(VUSs)可能通过引入功能研究中的PS3证据被升级为P/LP，我们从涉及同源重组(HR)修复(BLM、HFM1、MCM8、MCM9、MSH4和RECQL4)和卵泡发生(NR5A1)的七个常见POI致病基因中实验证实了75个VUSs。其中55个变异被确认为有害，其中38个从VUS升级为LP。在同一基因中同一患者中出现的两个P/LP杂合突变经T-clone或10x

　　在 59 个已知基因中共鉴定出 195种 P/LP 变异，其中包括 108 种(55.4%)功能丧失(LoF)变异，81 种(41.5%)错义变异，四种(2.1%)内框缺失或插入以及两种(1.0%)剪接区域变异。在这些基因中，EIF2B2基因在病例中携带致病等位基因的患病率最高(16，0.8%)，其中最常见的变异型p.Val85Glu(四个杂合子，五个纯合子和一个与另一个LP变异型p.Lys273Arg合并)被描述为导致一名日本患者出现SA的原因，因为它损害了GDP/GTP交换活性。

　　PA和SA的独特遗传特征

　　为了探究不同闭经类型的遗传特征，我们比较了PA和SA患者P/LP变异的贡献率。在120名PA患者中，31名(25.8%)女性携带P/LP变异，其中21名(17.5%)为单等位变异，7名(5.8%)为双等位变异，3名(2.5%)为多杂合变异。相比之下，SA患者的P/LP变异贡献率明显较低(162/910，17.8%)，其中134名为单等位(14.7%)，17名为双等位(1.9%)，11名为多杂合(1.2%)。PA患者中双等位和多杂合P/LP变异的频率明显较高，这表明遗传缺陷的累积效应可能影响POI的临床严重程度。

　　确定了20个新的POI候选基因

　　为了进一步研究富集基因和与POI相关的潜在遗传缺陷，我们对内部对照组进行了变异和基因水平的病例-对照关联分析。内部对照组来自HuaBiao项目，包括5,000名无关个体，使用与病例相同的外显子捕获试剂盒生成，并具有类似的测序统计数据。

　　为此，我们首先建立了一个手工筛选的包括703个基因的列表(包括已知的与卵巢功能相关的POI致病基因)，这些基因涉及卵巢功能。其中大多数基因参与了卵泡启动和发育的不同阶段，包括生殖腺发育、卵母细胞发育、卵泡发育、卵母细胞成熟和排卵。为了减少偏倚，我们剔除了在病例组或对照组中编码区域内reads平均覆盖率<30×的基因，最终在进一步的关联分析中包括了646个基因。此外，同义突变的burden测试显示在病例组和对照组之间没有显著差异。

　　在编码模型(外显子和剪接区变异)中，所有符合特定标准(方法)的合格变异都经过单侧Fisher's exact检验进行关联分析，这些分析确定了对照组的639个基因中的41046个变异，以及病例组的628个基因中的11981个变异。结果表明，在变异水平的关联检验中，EIF2B2 p.Val85Glu是唯一有显著性差异的变异。

　　然后使用基于基因的burden方法来识别新的候选基因。简而言之，我们确定了罕见(MAF < 0.001)可能的LoF变异，或可能有害的错义(D-mis)变异，然后将符合条件的等位基因聚合到基因中，并使用单侧Fisher确切性检验检验病例和对照之间的差异。LoF模型包括在总队列(病例和对照)中鉴定的433个基因中的1,439个变异。在使用Benjamini-Hochberg方法进行多重检验校正后，将FDR设置为0.3作为阈值。最终，32个基因通过了LoF等位基因在病例中显著富集的阈值。其中，有20个基因在POI患者中以前没有被确认过。特别是，ZAR1表现出最大的富集，紧随其后的是ZP3，两者的FDR均为1.1%。

　　此外，在 D-mis 模型中，我们使用多种算法来识别在病例中具有明显更多有害错义变异的基因，而在对照组中则较少(方法)。只有三个 POI 基因(NR5A1、FSHR 和 EIF2B2)富集了更多被至少四项标准预测为有害的变异，FDR < 0.3。然而，这三个基因都是众所周知能导致 POI。在这项分析中未发现其他致病基因可能是由于评估错义变异致病性比较困难。

　　在LoF模型中，基因组合分析鉴定了20个新的候选基因。我们进一步研究了它们的功能，并根据ACMG指南评估了每个变异的致病性。LoF变异在不同位置的分布以及涉及的关键功能结构域显示在扩展数据中。新候选基因的功能和LoF变异的潜在有害影响中有详细说明。

　　总之，这项研究详细描述了POI中致病变异的特征，拓宽了已知POI相关基因的范围，描绘了这种疾病的遗传概览。扩大队列规模、父母-子女三联体测序、先进的基因组技术和国际合作研究对于克服本研究的局限性、进一步确定POI的遗传病因至关重要。此外，绘制卵巢功能有差异的个体(如卵巢储备减少、早期更年期和POI)的遗传概览，可能有助于理解生殖衰老中的共同遗传因素。

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