全面解读：妊娠早期无创亲子鉴定游离DNA浓度

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更新时间：2023-07-22 17:09:55发布时间：24小时内

　　随着高通量测序技术的成熟，基于孕妇外周血中cffDNA(胎儿来源的游离DNA)的无创产前筛查技术越来越多应用于胎儿染色体数目异常、单基因疾病检测及亲缘关系的鉴定等。但受检测技术灵敏度的制约，无创产前筛查技术要达到高效检测的标准，cffDNA浓度需达到孕妇血浆游离DNA总量的4%以上。因此，了解孕妇血浆游离DNA中的cffDNA浓度对无创产前筛查十分重要。

　　《中华妇产科杂志》刊登了一篇《妊娠早期游离DNA浓度研究》的论著，该研究全程由蓝沙生物核心技术团队实验并撰写，对孕5-37周的168名单胎正常孕妇进行研究，确证了孕妇血浆cffDNA浓度与孕周的相关性、不依赖父亲DNA的孕妇血浆测出cffDNA的可能性。

　　PART 01、样本来源

　　常州市第二人民医院就诊、孕5-37周的单胎正常孕妇168人。

　　其中孕早期(5-12周)104人，孕中期(13-27周)55人，孕晚期(28-37周)9人，分别占比61.9%、32.7%、5.4%，孕次为(2.0±0.7)次，产次为(0.5±0.6)次，年龄为(32±3)岁。

　　PART 02、实验材料

　　被试外周血15ml/人
　　专用采血管[美国STRECK公司产品]
　　cfDNA提取试剂盒[德国QIAGEN公司产品]
　　乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管
　　DNA抽提试剂盒[上海莱枫生物科技有限公司产品]
　　Qubit3.0荧光计[美国Thermo Fisher公司产品]
　　二代测序平台
　　illumina X-Ten测序平台

　　PART 03、实验过程

　　第一步

　　使用游离DNA专用采血管采集孕妇15ml外周血，4℃，1600g，离心10min，取清液二次离心，将血浆分装标记并保存在-80℃冰箱。取1.8ml血浆提取血浆cfDNA。

　　第二步

　　抽取孕妇配偶5ml外周血至EDTA抗凝管，取400μl抽提外周血DNA用于检测父亲SNP位点信息。

　　第三步

　　使用Qubit3.0荧光计对DNA进行定量，使用10ng游离DNA孕妇血浆标本，100ng基因组孕妇配偶血标本分别进行二代测序的文库构建，采用液相杂交捕获技术对5800个SNP位点进行目标区域捕获，使用illumina X-Ten对捕获的5800个SNP位点进行双端测序，每端测150个碱基，每个样本测1000万条序列。

　　第四步

　　去除接头和低质量值序列的高通量测序数据，使用序列比对软件BWA将处理后的测序序列与人类基因组序列参考图谱进行比对，然后使用samtools软件获得5800个SNP位点的分型信息，并计算每个SNP位点的支持序列数。

　　PART 04、实验结果

　　74例依赖父亲DNA的孕妇血浆DNA测序法检测出的孕妇cffDNA浓度为(9.1±5.8)%，浓度范围为1.8%~30.2%;这74例行不依赖父亲DNA的孕妇血浆DNA测序法检测出的孕妇cffDNA浓度为(9.0%±5.7)%，浓度范围为1.7%~30.1%。

　　这两种方法的检测结果一致，且显著相关，表明不依赖父亲DNA的孕妇血浆靶向深度测序法仅需孕妇血浆即可实现准确的孕妇血浆游离DNA浓度评估，解决了临床上父亲DNA取样不便的问题。

　　不依赖父亲DNA的孕妇血浆靶向深度测序法检测168例孕妇血浆的cffDNA浓度为(8.8%±5.1)%，其中孕5周者最低，孕37周者最高，分别占比1.7%、27.2%。此外，孕5~12周、孕13~27周、孕28~27周者的血浆cffDNA浓度分别随孕周的增加而显著增加、无显著变化和显著增加。孕妇血浆cffDNA浓度≥4%者的比例中，孕13~37周的64例孕妇中，仅有1例孕妇的cffDNA浓度<4%;孕5~12周的104例孕妇中，cffDNA≥4%孕妇的比例在孕周5~9周随着孕周增加而显著增加。

　　这表明，在孕5周即能检测到游离DNA，且在孕5~12周随着孕周的增加而显著增加，孕13~27周进入平台期，孕28周后又随着孕周的增加而升高，这与既往国内外研究结论一致。

　　我们秉持“科研是将领，实践是士兵”的至理名言，用科学的检测手段和精湛的检测技术鉴定每一份送到自有实验室的样本，一切为了给予客户准确无误的鉴定结论。